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人類中超過30%的編碼蛋白質(zhì)的基因表達細胞外或細胞表面蛋白質(zhì)。其中許多蛋白在各種病理生理條件下發(fā)揮著關(guān)鍵作用。近年來，靶向蛋白降解（TPD）技術(shù)已成為靶向傳統(tǒng)不可成藥蛋白的新型高效治療方式。然而，大多數(shù)TPD相關(guān)策略，包括PROTAC、分子膠和AUTAC等，只能降解胞質(zhì)蛋白或具有胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的膜蛋白。在此，作者報道了iLYTACs，并通過一系列實驗證實了iLYTAC可以用于擴展當前LYTAC和相關(guān)技術(shù)的潛在應用。下載化學加APP到你手機，更加方便，更多收獲。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

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(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

IGF2R結(jié)構(gòu)域11特異性結(jié)合IGF2。結(jié)合后，IGF2–IGF2R復合物經(jīng)歷細胞運輸進入溶酶體，最終導致IGF2降解。作者首先驗證了IGF2的這種特殊性質(zhì)可以被用作一種有效的溶酶體靶向受體（LTR）配體，以實現(xiàn)細胞外和膜蛋白的廣泛有效的溶酶體遞送和降解（圖1A、B和S1）。在概念驗證實驗中，作者證實了細胞外生物素結(jié)合蛋白NeutrAvidin protein DyLight 650/488（NA650/NA488，圖1C和S2）的成功細胞攝取和溶酶體遞送。細胞的蛋白質(zhì)組裂解物的凝膠內(nèi)熒光掃描分析顯示，IGF2介導的NA488攝取與時間相關(guān)，顯著攝取在2小時開始發(fā)生，并持續(xù)24小時（圖S2C），且在洗出后2小時明顯觀察到NA488帶的熒光強度顯著降低，表明NA488的溶酶體降解成功。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

隨后，作者試圖將基于IGF2的iLYTAC建立為一個通用、方便和模塊化的平臺（圖1D）。I型iLYTACs是IGF2與POI結(jié)合物或納米體融合的產(chǎn)物，即IGF2-TB。II型iLYTAC（也稱為IGF2-Z）是免疫球蛋白G（IgG）的Z結(jié)構(gòu)域與IGF2融合，從而能夠融合大多數(shù)市售mAb（圖1E）。作者總共構(gòu)建了四種I型iLYTACs，即IGF2-Af_EGFR、IGF2-Af_Syn、IGF2-Nb_GFP和IGF2-Nb_PDL1。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

接下來，作者進行了BLI實驗，確證了iLYTACs中的IGF2仍保持對IGF2R的結(jié)合活性（圖2E和S7）。用LysoTracker Green對IGF2-TB處理的細胞進行的進一步共定位實驗顯示，大多數(shù)內(nèi)化的IGF2-TB的溶酶體定位成功（圖2I和S8C）。作者在K562和HeLa細胞中用IGF2-Af_EGFR進行了競爭攝取測定（圖S9A），進一步驗證了IGF2/IGF2R輔助攝取IGF2-TB。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

接下來，作者確證了iLYTACs能夠介導疾病相關(guān)的細胞外蛋白和膜蛋白的溶酶體降解（圖3A–D和S10A，B）。此外，添加了溶酶體抑制劑Baf和氯喹CQ后顯著抑制了EGFR降解，進一步證實了溶酶體降解機制（圖3E）。作者進一步評估了IGF2-Af_EGFR如何影響EGFR的下游信號傳導。急性EGF刺激（100 ng/mL，20分鐘）沒有降低EGFR水平，但顯著增強了磷酸化（圖3F，泳道2）。單獨用IGF2或Af_EGFR預處理沒有改變EGF刺激后EGFR的Y1068的磷酸化狀態(tài)（圖3F，泳道3和4）。然而，作者觀察到pEGFR表達在IGF2-Af_EGFR處理的細胞中顯著減少（圖3F，泳道5），這表明與西妥昔單抗（Cet）/Af_EGFR結(jié)合相比，IGF2-AfEGFR去除EGFR在抑制下游激酶信號傳導方面更有效。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

為了進一步驗證iLYTACs的普適性和靈活性，作者接下來設計并得到了靶向PD-L1的iLYTACs IGF2-Nb_PDL1和IGF2-3-Nb_PDL1。觀察到了與IGF2-Af_EGFR類似的效果（圖3G、H、S10D和S8D）。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

隨后，作者進一步評估了iLYTAC介導的細胞外蛋白降解。GFP和α-Syn被用作靶向蛋白；相應的iLYTAC IGF2-Nb_GFP (圖 4A，4B）和IGF2-Af_Syn（圖4C，D）均對GFP和α-Syn表現(xiàn)出降解能力。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

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隨后，為了探索在II型iLYTAC（或IGF2-Z）的基礎上開發(fā)通用降解平臺的可能性，作者使用類似于生產(chǎn)I型iLYTACs的方法將IGF2-Z在大腸桿菌中表達、純化并表征（圖5A和S3–S8）。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

接下來，作者評估了IGF2-Z與Cet聯(lián)合是否可以降解內(nèi)源性EGFR（圖5E和S13A，B）；WB分析顯示，與Cet和IGF2-Z共同孵育的HeLa細胞內(nèi)的EGFR水平以劑量和時間依賴的方式顯著降低，在用摩爾比1:10 Cet/IGF2-Z 24小時孵育處理的細胞中觀察到有效的EGFR降解。IGF2和Z結(jié)構(gòu)域之間的連接體的長度不影響降解效率（圖S13C）。這種降解被溶酶體抑制劑抑制（圖5F）。免疫熒光和CLSM顯示，在用Cet+IGF2-Z處理的細胞中，膜結(jié)合的EGFR信號成功地輸送到主要的溶酶體（圖5G）。與用IGF2-Af_EGFR處理細胞的I型iLYTAC相比（圖3B–F），作者觀察到在EGF刺激后，用Cet+IGF2-Z處理的HeLa細胞中pEGFR和pAKT（S473；EGFR的下游靶標）的水平更顯著地降低（圖5H）。

為了進一步驗證IGF2-Z的普適性，作者研究了IGF2-Z降解CD20的能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用IGF2-Z+Ritu處理Raji細胞后，比單獨用Ritu或IGF2-Z處理的細胞的CD20水平低得多（圖5I和S13E）。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

隨后，作者選擇IGF2-Z來評估其在小鼠中的藥代動力學和生物分布。靜脈注射Cy5標記的IGF2-Z、Cet和Cy5（圖S14A）?；谔幚硇∈笪惭袩晒鈴姸鹊那宄曙@示，僅使用Cy5染料的清除率最快，其次是IGF2-Z，最后是Cet（圖6A），這與分子大小影響藥代動力學的已知現(xiàn)象一致。主要器官的離體熒光成像也顯示出類似的清除趨勢（圖S14B–D）；IGF2-Z與Cet的復合物形成并沒有顯著影響IGF2-Z的清除率，這可能是由于血液中IgG水平高得多。此外，在IGF2-Z或Cet-5-h處理的小鼠中，觀察到肝臟的攝取最高。5小時時在腎臟中檢測到強烈信號，表明IGF2-Z正在迅速從血液循環(huán)中清除（圖6B和S14D）。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

隨后，作者使用HeLa細胞異種移植的Balb/c裸鼠，在體內(nèi)評估iLYTACs的治療潛力。結(jié)果表明，用IGF2-Z+Cet治療的小鼠的腫瘤體積和重量下降了～50%，而用IGF2-Af_EGFR治療的小鼠腫瘤體積和體重下降水平略低（圖6E和F）。WB結(jié)果也表明通過使用iLYTAC，體內(nèi)EGFR成功降解（圖6G/H）。