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圖1：DBCO的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)性操控：（1）與疊氮的無銅催化環(huán)加成反應(yīng)；（2）酸催化重排反應(yīng)；（3）銀催化轉(zhuǎn)酰胺反應(yīng)。

　　疊氮-炔環(huán)加成反應(yīng)的點(diǎn)擊化學(xué)，被廣泛應(yīng)用于有機(jī)化學(xué)、藥物化學(xué)、化學(xué)生物學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等多學(xué)科領(lǐng)域。銅催化疊氮-炔點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)是一類高效的生物正交反應(yīng)，但銅催化體系在生物體系中具有較差的生物相容性。環(huán)張力炔基如DBCO、BCN等可以在無銅催化的溫和條件下實現(xiàn)疊氮-炔基的環(huán)加成，極大地促進(jìn)了點(diǎn)擊化學(xué)在活生物體系中的應(yīng)用。

　　上海藥物所黃蔚研究員和楊偉波研究員合作，發(fā)現(xiàn)環(huán)張力炔基DBCO結(jié)構(gòu)可以在酸性條件下重排喪失其點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)活性。通過研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，銀試劑AgNTf2或AgOAc可以在中性條件下促進(jìn)DBCO快速重排生成四環(huán)產(chǎn)物，并且當(dāng)反應(yīng)體系有胺類化合物時，會發(fā)生轉(zhuǎn)酰胺反應(yīng)，形成新的酰胺產(chǎn)物。在此過程中，銀試劑催化轉(zhuǎn)酰胺反應(yīng)具有“籠縛”?；噭傩裕簾o催化劑條件下其?；钚浴笆`”在DBCO“籠狀”結(jié)構(gòu)中，而在銀催化下從“籠”中釋放其?；芰?。在與疊氮基團(tuán)的競爭反應(yīng)中，銀試劑催化轉(zhuǎn)酰胺反應(yīng)效率遠(yuǎn)高于疊氮點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，酰化產(chǎn)物產(chǎn)率高達(dá)95%。

圖2：銀催化DBCO轉(zhuǎn)酰胺反應(yīng)的底物適應(yīng)性。DBCO結(jié)構(gòu)包含Succinyl-DBCO、FITC-DBCO、Cy5-DBCO等；氨基底物包含氨基酸、多肽、糖肽、蛋白、糖蛋白和噬菌體。

　　研究團(tuán)隊選擇了不同的含有氨基的小分子化合物、多肽、糖肽、蛋白、糖蛋白等，對該反應(yīng)進(jìn)行了底物反應(yīng)活性和選擇性的探索（圖2）。研究發(fā)現(xiàn)，銀催化條件下，DBCO可以快速的?；被倌軋F(tuán)；針對三種包含20種天然氨基酸的多肽底物的研究發(fā)現(xiàn)，DBCO?；磻?yīng)高選擇性地發(fā)生在Lys的氨基上，而不影響其他氨基酸。同時，銀催化DBCO?；磻?yīng)可以高效地修飾糖肽、BSA蛋白、糖蛋白RNase B 和IgG抗體等，表現(xiàn)出較好的底物適用性。此外，銀催化?；磻?yīng)可以實現(xiàn)Ph.D.12商業(yè)噬菌體庫的修飾且不影響噬菌體侵染活力，說明該方法具有應(yīng)用于活生物體系中的潛力。

　　該研究團(tuán)隊還設(shè)計了一種DBCO標(biāo)記的抗體Fc靶向肽，實現(xiàn)了抗體上特定Lys的定點(diǎn)?；揎棧▓D3）。利用靶向肽與抗體Fc的親和力，將其DBCO標(biāo)記基團(tuán)運(yùn)輸?shù)終249附近，在此過程中，DBCO的?；钚蕴幱凇盎\縛”狀態(tài)而不會與抗體發(fā)生隨機(jī)偶聯(lián)。而在銀催化下，DBCO重排，相應(yīng)?；x擇性地修飾Fc區(qū)域的K249，高效實現(xiàn)了抗體的定點(diǎn)偶聯(lián)，為定點(diǎn)抗體藥物偶聯(lián)物的設(shè)計提供了新的方法與思路。

圖3：DBCO標(biāo)記的Fc靶向肽應(yīng)用于曲妥珠單抗上K249的定點(diǎn)偶聯(lián)

　　綜上所述，銀催化下DBCO重排?；磻?yīng)，改變了DBCO的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)性，從一個疊氮點(diǎn)擊反應(yīng)試劑，轉(zhuǎn)變?yōu)楦咝А睾?、可控的“籠縛”酰化試劑，且具有很好的生物兼容性，可以應(yīng)用于多肽、糖肽、蛋白、糖蛋白、噬菌體等多種生物活性底物。此外，DBCO標(biāo)記的Fc結(jié)合肽可以選擇性地酰化抗體上的特定Lys，實現(xiàn)抗體的定點(diǎn)偶聯(lián)。該方法在化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，可以用于配體導(dǎo)向的靶蛋白定點(diǎn)修飾、配體-受體共價捕獲、相互作用蛋白-蛋白交聯(lián)等。

　　黃蔚課題組一直從事蛋白糖基化調(diào)控與修飾（Nat. Protoco. 2017, 1702; Org. Biomol. Chem. 2016, 9501; J. Am. Chem. Soc. 2012, 12308）、細(xì)胞表面糖鏈編輯(Nat. Chem. Biol. 2020, doi.org/10.1038/s41589-020-0551-8)、糖結(jié)構(gòu)藥物(Angew. Chem. Int. Ed. 2019, 6678; J. Med. Chem. 2018, 286)等方向研究；楊偉波課題組聚焦天然產(chǎn)物啟發(fā)的大環(huán)庫構(gòu)建新方法學(xué)研究，包括過渡金屬催化碳?xì)浠罨?、卡賓偶聯(lián)以及重排等。黃蔚課題組博士生施偉和博士后唐峰為文章共同第一作者，黃蔚研究員和楊偉波研究員為共同通訊作者。藥物所黃河課題組團(tuán)隊在抗體定點(diǎn)偶聯(lián)的位點(diǎn)鑒定中給予了技術(shù)支持，黃蔚課題組畢業(yè)研究生敖繼煒和郁群在項目早期酸催化DBCO重排工作中作出了重要貢獻(xiàn)，為文章合作作者。該項目獲得了國家自然科學(xué)基金、國家“重大新藥創(chuàng)制”專項等項目資助。

　　原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202009408

　　參考文獻(xiàn)：

　　1.Shi, W.; Tang, F.; Ao, J.; Yu, Q.; Liu, J.; Tang, Y.; Jiang, B.; Ren, X.; Huang, H.; Yang, W.*; Huang, W.* (2020) “Manipulating the click reactivity of dibenzoazacyclooctynes: from an azide cliker to a caged acylation reagent.” Angew. Chem. Int. Ed. DOI: 10.1002/anie.202009408