JACS：熒光化學(xué)探針用于受損細(xì)胞膜的免洗成像

來源：化學(xué)加原創(chuàng) 2024-05-06

導(dǎo)讀：近日，德國慕尼黑大學(xué)Oliver Thorn-Seshold教授在熒光化學(xué)探針的設(shè)計(jì)合成及受損細(xì)胞膜的成像方面取得新進(jìn)展，相關(guān)研究成果以“Fluorogenic Chemical Probes for Wash-free Imaging of Cell Membrane Damage in Ferroptosis, Necrosis, and Axon Injury”為題發(fā)表在Journal of the American Chemical Society上。本文報(bào)道了一種可以顯示受損細(xì)胞中整個(gè)細(xì)胞質(zhì)體積的高分辨率免洗熒光探針。其中，含二磺酸鹽的探針只能特異性地進(jìn)入膜受損的細(xì)胞中，然后被酶激活并對其進(jìn)行標(biāo)記。此外，作者通過對酯酶探針MDG1進(jìn)行處理后可得到不易水解的探針MDG2并實(shí)現(xiàn)了多色細(xì)胞成像。最后，作者證明了MDG探針可用于檢測受損的軸突細(xì)胞膜、區(qū)分活體中的受損細(xì)胞。MDG探針的設(shè)計(jì)合成為細(xì)胞膜免洗成像技術(shù)的發(fā)展提供了強(qiáng)有力的模塊化工具，同時(shí)能夠?qū)膊≈心p傷細(xì)胞的選擇性診斷與治療帶來啟發(fā)。文章鏈接DOI: 10.1021/jacs.3c07662.

正文

細(xì)胞膜也稱質(zhì)膜，是分隔細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞周圍環(huán)境的一層膜結(jié)構(gòu)。磷脂雙分子層是構(gòu)成細(xì)胞膜的基本骨架。在水環(huán)境中，磷脂分子的疏水尾部相互聚集，親水頭部則朝向外側(cè)形成雙分子層結(jié)構(gòu)。一些生理生化過程如壓力、機(jī)械性損傷和化學(xué)變化等會(huì)引起細(xì)胞膜損傷。雖然膜損傷會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，但這并非是一個(gè)不可逆過程。一般來講，通常帶有電荷的基團(tuán)如磺酸鹽等會(huì)降低分子的透膜性。帶電荷的成像探針通常會(huì)被用于檢測細(xì)胞膜的完整性以區(qū)分細(xì)胞的生存狀態(tài)。比如，Trypan Blue是一種四磺化陰離子親水染料，不易通過細(xì)胞膜，可用來判斷細(xì)胞的健康狀態(tài)。Propidium iodide（PI）是一種非滲透膜的紅色熒光染料。PI不能通過活細(xì)胞膜但可以穿透受損細(xì)胞，因此通常用于鑒定細(xì)胞的活力并常被用于熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀當(dāng)中（Figure 1a）。因此，發(fā)展可以檢測細(xì)胞膜完整性的小分子探針對于修復(fù)受損細(xì)胞至關(guān)重要。本文中，作者發(fā)展了檢測膜損傷的熒光探針（Figure 1b），該探針能夠?qū)崿F(xiàn)1）低背景熒光、免洗和免減影成像；2）區(qū)分細(xì)胞膜損傷細(xì)胞；3）受損細(xì)胞膜的特異性成像和4）高亮度的窄譜帶多色熒光成像。該探針的設(shè)計(jì)思路對于研究如何將藥物選擇性地運(yùn)送到受損細(xì)胞中并對其進(jìn)行診斷與治療具有重要意義。化學(xué)加——科學(xué)家創(chuàng)業(yè)合伙人，歡迎下載化學(xué)加APP關(guān)注。

Figure 1.非滲透型細(xì)胞探針

（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

作者合成了新型含磺酸鹽的分子H₂-FS₁，該分子的激發(fā)和發(fā)射波長分別位于500 nm和525 nm?；诖耍髡哂衷O(shè)計(jì)合成了熒光探針i₂-FS₁和a₂-FS₁（Figure 2a）。在共聚焦成像實(shí)驗(yàn)中，探針i₂-FS₁，a₂-FS₁和H₂-FS₁由于其含有磺酸鹽基團(tuán)而被細(xì)胞“排斥”，展現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞外熒光信號（Figure 2b-c）。相比之下，含有酯基的i₂-FS₀和i₂-FS₁在細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度相當(dāng)。當(dāng)熒光分子的基團(tuán)被雙重O-酰化后，修飾一個(gè)磺酸鹽基團(tuán)不足以被細(xì)胞排斥。a₂-FS₁的細(xì)胞外熒光強(qiáng)度低于i₂-FS₁，說明異丁酸的親脂性促進(jìn)了分子被細(xì)胞吞噬。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的單峰數(shù)據(jù)也再次證明了以上觀點(diǎn)（Figure 2d）。

Figure 2. 不同種類探針染色健康細(xì)胞的熒光圖像

（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

為了調(diào)節(jié)分子對膜的透過性，作者合成了第二代含酯基探針（Figure 3a），最終分別得到了含有甲基（iMe-FS₁），氨基（iEM-FS₁）和磺酸鹽基團(tuán)（iPS-FS₂）的分子（Figure 3a-b）。其中，含雙磺酸鹽基團(tuán)的分子iPS-FS₂由于極性基團(tuán)的存在而被細(xì)胞排斥，幾乎沒有細(xì)胞內(nèi)熒光信號（Figure 3c，d）。作者通過誘導(dǎo)膜損傷以研究探針在受損細(xì)胞中的攝取和激活行為，共聚焦成像結(jié)果表明所有磺酸化的探針具有更高的細(xì)胞內(nèi)熒光信號，但只有iPS-FS₂最適合用于對受損細(xì)胞的免洗成像（Figure 3e-h）。

Figure 3. 探針染色受損細(xì)胞的熒光圖像

（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

在膜損傷的軸突組織模型中，MDG1探針被健康的細(xì)胞所“排斥”，但是卻能夠?qū)APH-受損細(xì)胞進(jìn)行選擇性染色（Figure 4a，b）。因此，基于膜電荷的差異，二磺酸化結(jié)構(gòu)的酯酶探針MDG1可以高靈敏度地檢測膜損傷。在進(jìn)入細(xì)胞后，MDG2比MDG1更具有水解穩(wěn)定性，更能有效地被硫醇“分解”，在受損細(xì)胞具有很高的熒光強(qiáng)度。因此，MDG系列探針為區(qū)分受損細(xì)胞提供了合成簡單、性質(zhì)靈活可調(diào)的小分子平臺(tái)（Figure 4c-e）。

Figure 4. 探針對受損細(xì)胞的細(xì)胞膜成像

（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

鐵死亡的主要機(jī)制是在二價(jià)鐵或酯氧合酶的作用下，催化細(xì)胞膜上高表達(dá)的不飽和脂肪酸，發(fā)生脂質(zhì)過氧化，從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。BODIPY是一種用于鐵死亡研究的常用分子（Figure 5f）。非氧化-還原依賴性的MDG1探針可以直接反映膜的完整程度。作者利用T細(xì)胞研究了MDG1能否用于鐵死亡過程的成像。流式細(xì)胞數(shù)據(jù)表現(xiàn)出明顯的增強(qiáng)（Figure 5a-e），與BODIPY-C11指示的過氧化程度相符（Figure 5f-k）。

Figure 5. 探針檢測鐵死亡過程中的膜損傷

（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

最后，作者用AAPH試劑破壞軸突組織后進(jìn)行成像，Propidium iodide（PI）并不能區(qū)分受損的軸突（Figure 6a），但MDG1能夠選擇性地示蹤受損軸突（Figure 6b），正常組織未發(fā)現(xiàn)有熒光信號（Figure 6c）。在果蠅胚胎的活體模型染色成像中，一般能夠觀察到DNA靶向的SYTOX57或者PI等非細(xì)胞滲透型染料的積累（Figure 6d）。同時(shí)，作者對比了細(xì)胞核靶向染料SYTOX Green和MDG1對受損胚胎的成像效果（Figure 6e-f），MDG1被證實(shí)具有良好的光學(xué)穩(wěn)定性和靶向性。

Figure 6. 探針檢測活體內(nèi)軸突和壞死組織中的膜損傷

（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

總結(jié)

德國慕尼黑大學(xué)Oliver Thorn-Seshold教授團(tuán)隊(duì)通過在分子設(shè)計(jì)中利用電荷和極性基團(tuán)的巧妙結(jié)合發(fā)展了用于細(xì)胞膜成像的探針“分子平臺(tái)”。開發(fā)了模塊化熒光探針，顯示受損細(xì)胞的整個(gè)細(xì)胞質(zhì)體積，具有接近零的背景熒光，因此不需要洗滌。相比于傳統(tǒng)受損細(xì)胞的成像染料，該MDG系列探針可以實(shí)現(xiàn)對受損細(xì)胞的細(xì)胞膜的高分辨率免洗熒光成像，并可以無損追蹤和量化一些生理變化過程中細(xì)胞膜的通透性。隨著化學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)學(xué)科的不斷發(fā)展，細(xì)胞膜熒光探針的應(yīng)用范圍越來越廣泛，對于了解細(xì)胞的生命活動(dòng)和疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。

文獻(xiàn)詳情：

Fluorogenic Chemical Probes for Wash-free Imaging of Cell Membrane Damage in Ferroptosis, Necrosis, and Axon Injury

Philipp Mauker, Daniela Beckmann, Annabel Kitowski, Constanze Heise, Chantal Wientjens, Andrew J. Davidson, Simone Wanderoy, Gabin Fabre, Angelika B. Harbauer, Will Wood, Christoph Wilhelm, Julia Thorn-Seshold, Thomas Misgeld, Martin Kerschensteiner, and Oliver Thorn-Seshold*

J. Am. Chem. Soc. 2024
https://doi.org/10.1021/jacs.3c07662

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