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六氟異丙醇溶劑再現(xiàn)神奇：基于-酮醛試劑的訂書(shū)肽策略

來(lái)源：南開(kāi)大學(xué) 2024-03-11

導(dǎo)讀：環(huán)肽類化合物為藥物研發(fā)中化學(xué)空間的探索提供了強(qiáng)大的平臺(tái)。現(xiàn)階段，通過(guò)內(nèi)源性側(cè)鏈釘接天然肽的方法尚未得到充分探索，且主要基于半胱氨酸的反應(yīng)性。為了擴(kuò)大其適用范圍，開(kāi)發(fā)選擇性靶向非半胱氨酸的多肽修飾策略尤為重要。近日，南開(kāi)大學(xué)陳弓教授團(tuán)隊(duì)報(bào)道了通過(guò)α-酮醛化合物與雙胺交聯(lián)來(lái)對(duì)天然肽進(jìn)行環(huán)化（圖1）。該策略簡(jiǎn)單高效、適用廣泛，能夠構(gòu)建各種咪唑骨架的環(huán)肽產(chǎn)物。其中，六氟異丙醇（HFIP）溶劑的使用能加速環(huán)化過(guò)程，并實(shí)現(xiàn)對(duì)賴氨酸側(cè)鏈的高選擇性修飾。

圖 1. α-酮醛交聯(lián)雙胺構(gòu)建環(huán)肽

α-酮醛類化合物在生命體內(nèi)由糖代謝產(chǎn)生，能夠與蛋白質(zhì)反應(yīng)生成晚期糖基化終末產(chǎn)物（圖2A和2B）。鄰位二羰基結(jié)構(gòu)給α-酮醛帶來(lái)獨(dú)特的反應(yīng)性，使其在生理?xiàng)l件下無(wú)需酶催化即可與各種含N基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)。α-酮醛和含N官能團(tuán)的縮合可能會(huì)發(fā)生不尋常的重排反應(yīng)（圖1C），生成兩分子交聯(lián)的產(chǎn)物GOLD和MOLD或賴氨素羧基化產(chǎn)物CML和CEL。此外，該過(guò)程還能夠生成精氨酸修飾產(chǎn)物hydroimidazolone和argpyrimidine，或賴氨素與精氨酸交聯(lián)產(chǎn)物MODIC（圖2B）。

迄今為止，α-酮醛類化合物在生物醫(yī)藥中僅成功應(yīng)用于對(duì)蛋白質(zhì)中精氨酸殘基的標(biāo)記（圖2A）。相比之下，α-酮醛與胺的反應(yīng)卻報(bào)道的很少。在Baynes課題組的仿生研究中，他們發(fā)現(xiàn)GO可以和簡(jiǎn)單的烷基胺在生理?xiàng)l件下生成中等收率的GOLD產(chǎn)物（圖2D）。然而，該策略同時(shí)也會(huì)生成大量的N烷基化副產(chǎn)物。隨后，Esposito課題組報(bào)道了在AcOH和H₂O的混合溶劑中額外引入甲醛的方法，可以高效地得到GOLD產(chǎn)物（圖2D）。值得注意的是，這兩種方法都只在簡(jiǎn)單的烷基胺底物上進(jìn)行了驗(yàn)證，對(duì)于精氨酸潛在的干擾問(wèn)題仍未解決。

圖 2. GO和MO的相關(guān)反應(yīng)

近年來(lái)，南開(kāi)大學(xué)陳弓教授課題組報(bào)道了多種基于甲醛的高效且選擇性優(yōu)異的復(fù)雜多肽修飾方法（Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 6646；J. Am. Chem. Soc. 2022, 144, 10080；J. Am. Chem. Soc. 2024, 146, 5952），其中六氟異丙醇溶劑能顯著促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。同時(shí)受到蛋白質(zhì)糖基化中MODIC連接體的啟發(fā)，作者嘗試將乙二醛化合物在六氟異丙醇中用于多肽的環(huán)化修飾。作者首先嘗試了三肽NA-Arg-Gly-Lys-NH2（NA：2-萘甲?；?，用于增強(qiáng)多肽LCMS分析的UV檢測(cè)）與乙二醛在六氟異丙醇中進(jìn)行反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)該反應(yīng)并沒(méi)有生成預(yù)想的Arg-Lys交聯(lián)的MODIC產(chǎn)物，而是主要生成了GOLD產(chǎn)物。隨后，作者嘗試用含有兩個(gè)Lys的模板肽NA-Lys-Gly-Ala-Lys-OH 3通過(guò)乙二醛進(jìn)行分子內(nèi)的關(guān)環(huán)。作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用3當(dāng)量的GO和3當(dāng)量的DIPEA在10 m濃度的六氟異丙醇中反應(yīng)30 min即可定量轉(zhuǎn)化成GOLD環(huán)肽產(chǎn)物。

隨后，作者對(duì)多肽底物的適用性進(jìn)行考察（圖3）。作者發(fā)現(xiàn)，除半胱氨酸外，該反應(yīng)對(duì)其余天然氨基酸均具有良好的兼容性。含有Tyr（7）、His（8）、Trp（13）、Thr（9）、Ser（9）、Asp（10）、Asn（20）和Met（17）的多肽底物對(duì)該反應(yīng)均耐受。作者發(fā)現(xiàn)巰基底物NA-Cys-OH 25能夠和GO生成硫代半縮醛產(chǎn)物26及其他一些復(fù)雜產(chǎn)物。精氨酸底物NA-Arg-OH 27，能夠在標(biāo)準(zhǔn)條件下與乙二醛反應(yīng)生成小于3%的28a和28b的混合物。由此可見(jiàn)，Arg在六氟異丙醇中的反應(yīng)活性明顯低于Lys，特別是與兩個(gè)Lys的交聯(lián)反應(yīng)相比。對(duì)于含有精氨酸的多肽底物10和14，均能高選擇性的得到GOLD產(chǎn)物。同時(shí)作者也發(fā)現(xiàn)，如果加入大過(guò)量的GO或者延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，也會(huì)監(jiān)測(cè)到精氨酸修飾的產(chǎn)物11。兩個(gè)賴氨酸的距離對(duì)于環(huán)化效率沒(méi)有顯著影響。此外，該反應(yīng)對(duì)于多種具有生物活性多肽也具有良好的反應(yīng)效果，如環(huán)肽抗生素gramicidin S和N-Ac GLP-1均可以高效轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的環(huán)化產(chǎn)物。除了對(duì)兩分子賴氨酸交聯(lián)，該策略同樣適用于N端與賴氨酸的環(huán)化，如23和24。

圖 3. 多肽部分底物拓展

該反應(yīng)對(duì)烷基和芳基取代的α-酮醛衍生物也具有良好的反應(yīng)效果，能夠生成各種官能化咪唑交聯(lián)的環(huán)肽產(chǎn)物（圖4）。值得注意的是，取代的乙二醛參與反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致生成的咪唑結(jié)構(gòu)含有一對(duì)異構(gòu)體。其中，各種取代的α-酮醛可以通過(guò)SeO₂氧化的Riley反應(yīng)輕松制備。α-酮醛上烷基取代基可能會(huì)降低多肽環(huán)化的效率，因此需要4當(dāng)量的乙二醛底物在40 ^oC下反應(yīng)4小時(shí)才能較好的轉(zhuǎn)化。各種鏈狀烷基及環(huán)狀烷基取代的乙二醛底物均能與模板肽3反應(yīng)得到相應(yīng)的環(huán)化產(chǎn)物（4a-4e）。對(duì)于芳基取代的α-酮醛底物需要升溫至60 ^oC反應(yīng)12小時(shí)才能實(shí)現(xiàn)定量轉(zhuǎn)化。如底物4f-4p所示，該反應(yīng)對(duì)苯環(huán)上的各種取代基均具有良好的耐受性。此外，該反應(yīng)還可以在咪唑結(jié)構(gòu)上引入炔基（4r），呋喃基（4q），萘基（4s），芘基（4v）和四苯乙烯熒光基團(tuán)（4t），進(jìn)一步豐富環(huán)肽骨架的多樣性。值得注意的是，芳基乙二醛可能會(huì)發(fā)生自身反應(yīng)，生成不同數(shù)量的未識(shí)別副產(chǎn)物。然而，這些副產(chǎn)物不會(huì)影響環(huán)化的進(jìn)程，并且可以通過(guò)乙醚后處理輕松的除去。

圖 4. α-酮醛部分的底物拓展

如圖5A所示，咪唑骨架的交聯(lián)反應(yīng)還可以在固相上高效進(jìn)行。作者首先用Rink樹(shù)脂通過(guò)固相合成方法制備了線性序列。其中，參與交聯(lián)的賴氨酸的殘基用Dde基團(tuán)正交保護(hù)。隨后，Dde保護(hù)基可以在5%的水合肼的DMF溶液中選擇性脫除，并將脫去Dde的樹(shù)脂在六氟異丙醇中與不同α-酮醛化合物進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)。最后，用TFA/H₂O的混合液將多肽從樹(shù)脂上裂解下來(lái)，并通過(guò)制備級(jí)HPLC純化，得到相應(yīng)的環(huán)肽產(chǎn)物。

Anoplin是一種具有多種藥理活性的短型兩親性α-螺旋毒液肽。最近，有課題組報(bào)道Anoplin可以通過(guò)金屬催化的烯烴復(fù)分解反應(yīng)進(jìn)行裝訂，來(lái)產(chǎn)生對(duì)癌細(xì)胞具有溶瘤活性的環(huán)肽。作者通過(guò)兩輪概念驗(yàn)證研究，將α-酮醛介導(dǎo)的固相裝訂反應(yīng)用于構(gòu)效關(guān)系探索以提高生物活性（圖5B）。在第一輪構(gòu)效關(guān)系研究中，作者通過(guò)變換兩個(gè)賴氨酸的位置和GO進(jìn)行反應(yīng)，得到相應(yīng)的GOLD產(chǎn)物。隨后，作者通過(guò)對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，篩選出環(huán)肽Ano-D和Ano-E具有較好的癌細(xì)胞殺傷效果。在第二輪實(shí)驗(yàn)中，作者基于Ano-D和Ano-E的序列，與修飾的α-酮醛進(jìn)行反應(yīng)，得到各種取代的咪唑環(huán)肽產(chǎn)物。作者通過(guò)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，篩選出效果更好的環(huán)肽產(chǎn)物，分別是正辛基取代的Ano-Dc（IC₅₀= 6.6 μM）和對(duì)三氟甲基苯基取代的Ano-Eh（IC₅₀= 6.8 μM）

圖 5. 構(gòu)效關(guān)系研究

作者基于前期HFIP促進(jìn)多肽修飾的探索，提出了針對(duì)HFIP促進(jìn)的條件下的新型MOLD反應(yīng)機(jī)制（圖6）。MO首先與烷基胺縮合成可逆的雙亞胺中間體I。另一分子MO與雙亞胺I反應(yīng)生成中間體II，隨后與體系中的H₂O反應(yīng)得到水合物III。中間體III能夠在HFIP的作用下，發(fā)生C-C鍵的斷裂，脫去CH₃COOH得到中間體IV。最后，中間體IV發(fā)生分子內(nèi)進(jìn)攻后脫水，得到最終的咪唑骨架產(chǎn)物。其中，中間體III的脫?；窃摲磻?yīng)的關(guān)鍵。作者也在最近的研究中（J. Am. Chem. Soc. 2024, 146, 5952）發(fā)現(xiàn)HFIP能夠形成聚集體，通過(guò)H鍵介導(dǎo)的大環(huán)過(guò)渡態(tài)進(jìn)行分子間的氫化物轉(zhuǎn)移。在該反應(yīng)中，作者認(rèn)為HFIP聚集體可能在氫鍵介導(dǎo)的大環(huán)過(guò)渡態(tài)中起到類似質(zhì)子梭的作用，加速脫?；倪M(jìn)程（結(jié)構(gòu)V所示）。

綜上所述，陳弓課題組開(kāi)發(fā)了利用不同取代的α-酮醛試劑，將天然多肽上兩個(gè)氨基通過(guò)咪唑結(jié)構(gòu)交聯(lián)。該方法可以在溫和的條件下高效高選擇性的構(gòu)建多種咪唑骨架環(huán)肽。其中，HFIP的使用是實(shí)現(xiàn)高反應(yīng)性的關(guān)鍵，使得該反應(yīng)對(duì)賴氨酸比精氨酸具有更高的化學(xué)選擇性。作者還將這些模塊化的裝訂反應(yīng)用于概念驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，通過(guò)方便的兩輪篩選策略來(lái)簡(jiǎn)化毒液肽Anoplin的溶瘤活性的構(gòu)效關(guān)系研究。

相關(guān)工作最近發(fā)表于Angew. Chem. Int. Ed.，通訊作者為南開(kāi)大學(xué)陳弓教授。南開(kāi)大學(xué)博士研究生郭盼為該論文的第一作者。https://doi.org/10.1002/anie.202318893

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