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蛋白質(zhì)是生命的基礎(chǔ)物質(zhì)，在合成、催化和信號(hào)傳感等所有生命活動(dòng)中均承擔(dān)著重要的功能。因此，開(kāi)發(fā)一種可靠、高效的蛋白質(zhì)測(cè)序技術(shù)對(duì)于理解生命過(guò)程和揭示疾病機(jī)理而言至關(guān)重要。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)測(cè)序方法，如質(zhì)譜法、Edman降解法，雖為蛋白質(zhì)領(lǐng)域做出了巨大貢獻(xiàn)，但其在檢測(cè)限和動(dòng)態(tài)范圍方面存在較大局限性，無(wú)法完全滿(mǎn)足現(xiàn)實(shí)應(yīng)用的需求，尤其是在低豐度蛋白質(zhì)標(biāo)志物的檢測(cè)方面。因此，如果能在單分子水平上實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的測(cè)序，將為檢測(cè)低豐度蛋白和實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)提供極高的靈敏度，并大大推動(dòng)相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展。
納米孔測(cè)序技術(shù)是近年來(lái)新興的一種單分子測(cè)序技術(shù)，已在DNA和RNA測(cè)序方面取得了巨大成功，這也激勵(lì)著研究者們對(duì)于蛋白質(zhì)或多肽納米孔測(cè)序的嘗試。但是多肽納米孔測(cè)序的實(shí)現(xiàn)面臨著諸多挑戰(zhàn)，其中一個(gè)主要的困難是如何實(shí)現(xiàn)多肽在納米孔中可控的棘輪運(yùn)動(dòng)，而這主要受限于目前沒(méi)有合適的多肽測(cè)序酶。
“納米孔錯(cuò)位測(cè)序技術(shù)（Nanopore-Induced Phase-Shift Sequencing, NIPSS）”是近年來(lái)由南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院黃碩課題組原創(chuàng)開(kāi)發(fā)的一種新型測(cè)序技術(shù)，作為一種通用的測(cè)序技術(shù)，NIPSS已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)了除DNA外其他生物大分子的測(cè)序，如非天然核酸（XNA）和microRNA的直接測(cè)序。在此工作中，南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院黃碩課題組使用NIPSS技術(shù)成功展示了多肽的納米孔測(cè)序技術(shù)原型（圖1）。
圖1：基于NIPSS的多肽納米孔測(cè)序技術(shù)原型展示。
為了驗(yàn)證NIPSS技術(shù)進(jìn)行多肽測(cè)序的可行性，我院黃碩課題組構(gòu)建了多肽-DNA嵌合鏈（圖1 A）。嵌合鏈的DNA部分為“驅(qū)動(dòng)鏈”，在NIPSS檢測(cè)過(guò)程中（圖1B），DNA測(cè)序酶通過(guò)拉動(dòng)DNA部分實(shí)現(xiàn)了整條多肽-DNA嵌合鏈在納米孔中的可控棘輪運(yùn)動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)了多肽的納米孔直接讀取。多肽的NIPSS信號(hào)表現(xiàn)出高度的一致性和序列相關(guān)性，由單氨基酸替換引起的電流變化也能被清楚地檢測(cè)到。通過(guò)將多肽的N端或C端與DNA驅(qū)動(dòng)鏈進(jìn)行偶聯(lián)，我院黃碩課題組也成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)多肽兩端氨基酸序列信息的讀取。
該工作以“Single molecule ratcheting motion of peptides in a Mycobacterium smegmatis porin A (MspA) nanopore”為題，于2021年7月28日在《Nano Letters》發(fā)表相關(guān)論文（DOI：10.1021/acs.nanolett.1c02371，文章鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.nanolett.1c02371）。我院閻雙紅博士為該論文第一作者，我院黃碩教授為該論文通訊作者。此項(xiàng)研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號(hào)：31972917, 91753108, 21675083）、江蘇省高層次創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新人才引進(jìn)計(jì)劃（個(gè)人、團(tuán)體計(jì)劃）、江蘇省自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號(hào)：BK20200009）等經(jīng)費(fèi)支持。
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