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 （圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

多個生物標(biāo)志物的實(shí)時同步成像不僅為研究生物體內(nèi)某一病理通路內(nèi)不同生物標(biāo)志物之間的基本相關(guān)性提供了獨(dú)特的機(jī)會，而且提高了疾病診斷的準(zhǔn)確性。可激活的熒光探針因其對目標(biāo)生物標(biāo)志物具有較高的敏感性和特異性，已成為醫(yī)學(xué)上有價值的工具。然而，目前用于雙生物標(biāo)志物成像的研究還很少，更不用說多生物標(biāo)志物成像了。由于這些探針通常依賴于兩種熒光分子的各自激活導(dǎo)致發(fā)射光譜重疊而常常發(fā)生信號串?dāng)_，這可能會影響生物標(biāo)志物的分辨率。與熒光探針相比，化學(xué)發(fā)光(CHL)探針由于消除了實(shí)時光激發(fā)，使得背景噪聲最小。然而，大多數(shù)CHL底物在生理?xiàng)l件下都有微弱的發(fā)光。

為改善化學(xué)發(fā)光和熒光在雙生物標(biāo)志物成像的不足，南洋理工大學(xué)浦侃裔課題組合成了雙生物標(biāo)志物成像的單分子化學(xué)/熒光報告劑（CFR）。CFR可以用于DIH成像。由于氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡在炎癥反應(yīng)和肝功能衰竭出現(xiàn)之前的DIH早期就被發(fā)現(xiàn)上調(diào)，因此選擇O₂^??和casp3作為CFR設(shè)計(jì)的早期生物標(biāo)志物。CFR是第一種具有兩個獨(dú)立激活通道的光學(xué)小分子探針：用于檢測casp3的近紅外通道(NIRF)；用于檢測O₂^??化學(xué)發(fā)光通道（CHL）。NIRF部分是通過修飾半花菁的羥基實(shí)現(xiàn)的。能被casp3切除的多肽[Asp-Glu-Val-Asp]通過可自消除的連接基團(tuán)修飾到半花菁上。CHL部分是通過可以被O₂^??切除的三氟甲基磺酸（Tf）修飾的苯酚實(shí)現(xiàn)的。casp3的存在導(dǎo)致肽段與CFR的自消除連接基團(tuán)之間的酰胺鍵斷裂，然后通過1,6-消除自發(fā)生成半花菁，產(chǎn)生熒光。與產(chǎn)生熒光信號不同的是，化學(xué)發(fā)光信號是O₂^??攻擊CFR的磺酸酯產(chǎn)生的。O₂^??攻擊CFR的磺酸酯后，誘導(dǎo)Tf基團(tuán)去保護(hù)，產(chǎn)生高度不穩(wěn)定的苯酚-二氧乙烯衍生物。苯酚-二氧乙烯衍生物是一個中間產(chǎn)物，這個中間產(chǎn)物經(jīng)歷了自發(fā)的分解，并釋放出光子，產(chǎn)生CFL信號。

為了研究CFR的光學(xué)性質(zhì)和傳感能力，南洋理工大學(xué)浦侃裔教授課題組研究了在沒有或同時存在這兩種生物標(biāo)志物的條件下 CFR的吸收光譜、NIRF光譜和CHL光譜的情況。

 （圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

CFR在610 nm和660 nm處具有最大紫外吸收峰，幾乎沒有熒光或化學(xué)發(fā)CFR與casp3孵育后，由于肽段的裂解和半花菁的生成，CFR在690 nm處出現(xiàn)新的吸收峰，而HPLC證實(shí)了半花菁的生成。casp3對肽段的裂解使得NIRF在710 nm的熒光增強(qiáng)了12倍。在O₂^??存在的情況下，CHL信號在540 nm處被激活，此時CFR的吸收和NIRF的光譜性質(zhì)幾乎沒有改變。O₂^??誘導(dǎo)的的CHL是背景光的40000倍。這些數(shù)據(jù)表明，CFR分別通過NIRF和CHL的信號，靈敏特異的檢測casp3和O₂^??。

基于CFR光譜性質(zhì)的研究情況，他們將CFR用于小鼠肝細(xì)胞雙成像。用藥物丙戊酸（VPA）處理細(xì)胞，結(jié)果證實(shí)了CFR在活細(xì)胞中對casp3和O₂^??成像的可行性。

 （圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

隨后，他們在DIH小鼠模型上進(jìn)一步研究CFR用于雙成像的能力。CFR的體內(nèi)雙信號演化趨勢與體外結(jié)果相似。用VPA處理的小鼠，線粒體功能混亂，隨后過度產(chǎn)生O₂^??。ROS水平升高會導(dǎo)致DNA損傷和線粒體通透性轉(zhuǎn)變，激活casp3。最后，細(xì)胞凋亡發(fā)生，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和組織損傷。因此，CFR的雙信號演化和DIH的機(jī)理一致，這進(jìn)一步證實(shí)CFR在發(fā)生DIH時可以縱向和差異地檢測到O₂^??和casp3的上調(diào)。

 （圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

總結(jié)：南洋理工大學(xué)浦侃裔教授課題組設(shè)計(jì)了一種雙模態(tài)成像探針CFR,并證實(shí)了該探針可用于DIH的早期診斷。該探針具有兩個獨(dú)立的光通路，可以互不干擾的對O₂^??和casp3靈敏特異的檢測。CFR對DIH的臨床前藥物篩選和臨床診斷具有重要的應(yīng)用前景。CFR是第一種具有光激發(fā)和化學(xué)發(fā)光的雙成像小分子探針。這種CFR分子設(shè)計(jì)可以簡單地通過改變CHL和NIRF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)位點(diǎn)上的 帽子基團(tuán)，推廣到其他生物標(biāo)志物的雙成像。

撰稿人：犟子柳