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圖1. 酶性質(zhì)快速預(yù)測整合工具和AI輔助的組合突變預(yù)測網(wǎng)站式工具。

作為生物質(zhì)的重要組成，淀粉是自然界中廣泛存在的α-葡聚糖類碳水化合物，是植物通過光合作用將太陽能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能后，以顆粒形式儲(chǔ)存于種子、塊莖中的能量載體，廣泛富集于玉米、小麥等糧食作物中。此外，隨著合成生物學(xué)與生物催化技術(shù)的突破，目前已實(shí)現(xiàn)以“一碳化合物”為原料的人工淀粉創(chuàng)制，為應(yīng)對(duì)糧食安全、碳中和目標(biāo)及生物質(zhì)資源高效利用提供了顛覆性思路。

Amylomaltases (AMs, EC 2.4.1.25 at https://www.brenda-enzymes.org/)是淀粉修飾的關(guān)鍵酶，其可通過獨(dú)特的環(huán)化特征調(diào)控α-葡聚糖的生化特性，形成α-1,4-糖苷連接的大環(huán)多糖（Cycloamyloses; CAs），賦予自然廣泛存在以及人工創(chuàng)制淀粉顯著的健康益處和醫(yī)學(xué)價(jià)值。雖然CAs的工業(yè)應(yīng)用在快速發(fā)展，但AM獨(dú)特的環(huán)化過程的機(jī)制復(fù)雜性，以及轉(zhuǎn)糖苷酶家族中轉(zhuǎn)糖基化與水解的微妙相互作用仍然未知，制約了該生物質(zhì)利用關(guān)鍵酶的智能塑造和性能提升。

在這項(xiàng)研究中，作者利用大規(guī)模分子模擬、二維自由能計(jì)算、QM/MM量化計(jì)算，并結(jié)合生化實(shí)驗(yàn)，以原子分辨率揭示了AM的共價(jià)和非共價(jià)的完整催化循環(huán)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)糖基化過程（12.8 kcal/mol；圖2）優(yōu)于水解過程（17.5 kcal/mol），是AM生物催化的主要途徑。此外，糖基化后的非共價(jià)多糖鏈在酶表面的大規(guī)模移動(dòng)是環(huán)化過程的決定性因素，特別是對(duì)于聚合度大于30的α-葡聚糖底物，其中非共價(jià)步驟（≥13.6 kcal/mol）決定了CA的生產(chǎn)速率。

圖2. AM轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)示意圖。

在生化實(shí)驗(yàn)中，研究團(tuán)隊(duì)通過策略性地調(diào)節(jié)多糖鏈轉(zhuǎn)移步驟，獲得了57個(gè)活性增強(qiáng)的突變體（單突變體最多增加了2.3倍酶活性；圖3）。酶促動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明，酶性能的提升主要源于底物轉(zhuǎn)移途徑中酶與底物的親和力的降低，從而加快了α-葡聚糖鏈在AM表面的轉(zhuǎn)移，促進(jìn)環(huán)化。此外，作者進(jìn)一步利用Mass spectrometry，成功檢測到了在AM催化多糖底物后，生成了聚合度范圍為22至61的CAs，證實(shí)了理論計(jì)算的推測。

圖3. 五種不同聚合度多糖底物在AM表面運(yùn)動(dòng)過程的二維自由能圖譜、相互作用能計(jì)算識(shí)別突變位點(diǎn)、酶工程實(shí)驗(yàn)，以及酶促動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。

此外，研究團(tuán)隊(duì)還揭示了一直懸而未決的AM中轉(zhuǎn)糖基化和水解關(guān)系，量化了二者之間的動(dòng)力學(xué)競爭平衡（圖4），從而為設(shè)計(jì)具有更高效率和特異性的轉(zhuǎn)糖苷酶提供了關(guān)鍵的機(jī)制見解。這項(xiàng)研究從工業(yè)性能的角度對(duì)CA的生物合成過程進(jìn)行了系統(tǒng)的分子水平的解密，為AM家族提供了清晰的工程藍(lán)圖（圖5）。

圖4. AM中轉(zhuǎn)糖基化和水解關(guān)系研究。

圖5. AM環(huán)化和水解的自由能圖譜。

淀粉等生物質(zhì)因其低成本、廣泛分布和可再生性而在全球范圍內(nèi)得到越來越多的利用。通過生物催化進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以創(chuàng)造新的屬性是開發(fā)淀粉等α-葡聚糖在食品和健康行業(yè)等領(lǐng)域應(yīng)用的基本途徑。中科院印遇龍?jiān)菏奎c(diǎn)評(píng)該項(xiàng)研究揭示了AM生物催化的分子基礎(chǔ)，提升了該酶在α-葡聚糖修飾工業(yè)中的應(yīng)用價(jià)值；同時(shí)，該研究成果可擴(kuò)展到GH 13、57和77家族中的轉(zhuǎn)糖苷酶，推動(dòng)高附加值精細(xì)化學(xué)品和功能材料的高效生物創(chuàng)制。

這項(xiàng)研究近期發(fā)表在國際頂級(jí)期刊Journal of the American Chemical Society (Q1; IF: 15.6)，第一作者為中科院天津工業(yè)生物所博士后劉涵博士，天津科技大學(xué)聯(lián)合培養(yǎng)碩士生尚天文，和瑞典查爾姆斯理工大學(xué)Scott Mazurkewich博士；通訊作者為中科院天津工業(yè)生物所宗志友研究員，中科院天津工業(yè)生物所孫媛霞研究員，和中科院亞熱帶生態(tài)所印遇龍?jiān)菏俊?/span>該研究獲得了美國伊利諾伊大學(xué)計(jì)算化學(xué)家Christophe Chipot教授，瑞典查爾姆斯理工大學(xué)生物質(zhì)利用專家Johan Larsbrink教授，中科院天津工業(yè)生物所人工合成淀粉研究中心主任蔡韜研究員，天津科技大學(xué)研究生院、卓越工程師學(xué)院院長羅學(xué)剛教授，中科康源生物技術(shù)有限公司董事長張東遠(yuǎn)博士，安琪酵母股份有限公司生物質(zhì)技術(shù)中心總經(jīng)理胡駿鵬博士，中科院亞熱帶生態(tài)所王樂蒞副研究員，和中科院天津工業(yè)生物所支撐平臺(tái)張志丹高級(jí)工程師等的大力支持和協(xié)助。

團(tuán)隊(duì)長期招聘具有生物催化或計(jì)算化學(xué)專業(yè)背景的博士后，從事生物質(zhì)利用關(guān)鍵酶分子的機(jī)制研究和智能塑造，具有交叉學(xué)科研究經(jīng)歷者優(yōu)先考慮。待遇方面在享受中國科學(xué)院及研究所有關(guān)規(guī)定的薪酬外，還可疊加濱海新區(qū)人才補(bǔ)貼，待遇優(yōu)厚。應(yīng)聘者請(qǐng)將個(gè)人簡歷發(fā)送至zongzhy@tib.cas.cn。初選合格者，將電話或郵件通知面試。