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論文的通訊作者：葉宇軒

論文第一作者：王輝，高斌

論文通訊單位：西湖大學

近年來，酶催化劑因其選擇性控制精確、易于改造進化和綠色環(huán)保等獨特優(yōu)勢，越來越受到合成化學家的關注。自然界中存在一些天然催化羰基去飽和化反應的酶，但它們的底物普適性差，難以作為催化劑被廣泛應用。為了克服這些局限，西湖大學葉宇軒課題組從一類底物范圍好、熱穩(wěn)定性高、易于表達的烯還原酶出發(fā)，成功把其從還原酶改造成去飽和化酶 (圖1b)，建立了一個通用的酶催化羰基去飽和化反應平臺，合成了一系列含有遠端四級手性中心的高價值環(huán)己烯酮產(chǎn)物 (圖1c)。此酶催化反應體系條件溫和、操作簡單、易于放大，展現(xiàn)出與已有的化學合成方法互補的反應性和選擇性。

圖1. 酶催化羰基去飽和化反應。圖片來源：Nat. Chem.

作者首先建立了結(jié)構(gòu)多樣的烯還原酶庫，以4-甲基-4-苯基-環(huán)己酮1作為模型底物，在氧氣存在的條件下對ERED的脫氫反應性進行評估，發(fā)現(xiàn)CrS和GkOYE表現(xiàn)出較好的活性和對映選擇性控制。當溫度升高時，去飽和化反應性提高 (圖2a)。隨后作者以野生型CrS和GkOYE為起點，利用定向進化技術提高酶催化劑的反應效率。單突變體CrS1 (Y27L)、CrS2 (Y27C) 和CrS3 (Y27T) 分別以79% (98:2 er), 88% (98:2 er)和81% (97:2 er) 得到產(chǎn)物2；GkOYE-WT經(jīng)過三輪進化得到一個三重突變體GkOYE3 (D73G、C26S、Y28V)，可以以很高的效率催化2的生成 (96%，>99:1 er) (圖2b)。

圖2. 反應優(yōu)化和定向進化。圖片來源：Nat. Chem.

接著，作者收集了在定向進化中獲得的有益突變體，建立了去飽和化酶庫，并對反應的底物范圍進行了探索。作者首先測試了多種4-烷基-4-芳基取代的環(huán)己酮底物，均具有良好的耐受性 (圖3)。當使用含2-氨基苯基的環(huán)己酮作為起始原料8時，以99% (>99:1 er, >20:1 dr) 的收率得到環(huán)化的產(chǎn)物二氫吲哚酮9。值得注意的是，這種生物催化去飽和化方法對胺和硫醚等氧化敏感官能團表現(xiàn)出高的兼容性。此外，缺電子和富電子雜環(huán)都是能夠在改反應條件下被兼容。除甲基外的各種烷基取代基底物也可以實現(xiàn)高立體選擇性的脫氫。從相應的3-羥丙基底物18出發(fā)時，可以99%收率 (>99:1 er，>20:1 dr) 得到環(huán)化產(chǎn)物八氫色烯-7-酮19。此外，螺環(huán)底物 (20-23) 也能很好地轉(zhuǎn)化。然而，4-羥基苯基的環(huán)己酮24不能被酶催化體系兼容，可能是由于該底物是酶的抑制劑。

圖3. 4-烷基-4-芳基環(huán)己酮去對稱化脫氫反應。圖片來源：Nat. Chem.

無需進一步的酶工程改造，此去飽和化方法可以輕松擴展到具有其它取代基團的環(huán)己酮底物。二烷基取代的環(huán)己烯酮25-33可以被高效去飽和化。對于含有甲基和乙基這兩個差別很小的取代基的底物34，在沒有經(jīng)過定向進化的情況下仍然能以62:38 er得到目標產(chǎn)物。各類4-羥基-環(huán)己酮底物和4-酯基-環(huán)己酮底物都可以順利的發(fā)生反應。此外，甲氧基51、乙酰氧基52和氰基53取代的環(huán)己酮也能被酶兼容。單取代的環(huán)己酮也能成功地實現(xiàn)去飽和化，以中等至良好的收率和高水平的對映選擇性得到相應的產(chǎn)物54-58。4-羥基-4-炔基環(huán)己酮59在該條件下無法反應 (圖4)。

圖4. 其它類別環(huán)己酮的去對稱化脫氫反應。圖片來源：Nat. Chem.

此酶催化反應體系條件溫和，操作簡單，可以很容易進行放大。作者首先對模型反應進行了克級規(guī)模放大 (6.0 mmol)：使用細胞裂解液可以88% 的產(chǎn)率，>99:1 er獲得產(chǎn)物2，使用凍干裂解液可以81% 的產(chǎn)率、>99:1 er實現(xiàn)反應 (圖5a)。此外，作者以克級規(guī)模高效制備了 (+)-Mesembrine，一種具有血清素再攝取抑制活性的生物堿。通過酶促去飽和化過程制備的環(huán)己烯酮產(chǎn)物2是應用廣泛的合成前體，能夠高立體特異性的轉(zhuǎn)化為有價值的手性化合物62，或是經(jīng)歷底物控制的非對映選擇性Diel-Alder反應，生成了帶有三個相鄰立體中心的六氫萘酮63 (圖5c)。

圖5. 制備規(guī)模合成和產(chǎn)物衍生化。圖片來源：Nat. Chem.

最后，作者對這一反應的機理進行了探索。此脫氫反應的可能機理是 (圖6a): 底物在酶的活性空腔結(jié)合后，保守的酪氨酸殘基陰離子 (3的Y169) 對底物進行α-去質(zhì)子化，形成烯醇中間體Int1。隨后，一種反應機理是經(jīng)歷路徑A，Int1將β-氫負轉(zhuǎn)移至FMNox，得到去飽和化的烯酮產(chǎn)物2和FMNhq。此反應途徑與ERED催化的天然還原過程相反，符合微觀可逆性原理。另外一種反應機理是經(jīng)歷路徑B，Int1與FMNox進行單電子轉(zhuǎn)移 (SET)，生成相應的α-?；虚g體Int2和黃素半醌FMNsq，然后進行質(zhì)子轉(zhuǎn)移 (PT) 和另一個單電子轉(zhuǎn)移 (SET) 成2和FMNhq。此反應途徑與近期報道的ERED催化的單電子氧化反應類似。最后，在酶催化劑釋放產(chǎn)物2，FMNhq與空氣中的分子氧發(fā)生反應，經(jīng)歷黃素氫過氧化物中間體，形成過氧化氫并重新生成氧化態(tài)輔因子FMNox。

基于這個機理模型，作者首先利用氫氘交換實驗 (圖6b) 和基因敲除實驗 (圖6c) 證明了Y169氨基酸殘基對去飽和化反應的重要作用。自由基鐘實驗結(jié)果與β-氫負轉(zhuǎn)移機制一致 (圖6d)。接著，作者對該反應獨特的β-氫負轉(zhuǎn)移步驟進行了動力學研究，證明了反應的決速步是β-氫負轉(zhuǎn)移。α-和β-位的動力學同位素效應 (KIE) 與所提出的α-去質(zhì)子化和β-氫負轉(zhuǎn)移的反應途徑一致 (圖6e)。動力學實驗表明，定向進化后的突變體GkOYE3的催化去飽和化半反應速度比GkOYE-WT快約57倍，還原反應速度變慢約0.7倍，與氧反應速度比GkOYE-WT快約1.5倍?？傮w而言定向進化產(chǎn)生的突變體在所有三個關鍵基元步驟中都更適合去飽和化 (圖6f)。

圖6. 提出的機理，氫/氘交換實驗，動力學實驗。圖片來源：Nat. Chem.

葉宇軒課題組成功的解鎖了烯還原酶的全新非天然去飽和化反應性，把它們從還原酶改造成為了去飽和化酶。此創(chuàng)新生物催化去飽和化平臺展現(xiàn)出與已有方法互補的反應性和優(yōu)越的選擇性，具有較好應用潛力。作者通過系統(tǒng)的機理研究，加深對酶催化去飽和化機理的理解，為此反應體系的進一步發(fā)展奠定了基礎。

葉宇軒博士2013年于北京大學化學與分子工程學院獲得學士學位，指導教師為王劍波教授和張艷教授。2018年在美國麻省理工學院獲得博士學位，指導教師為Stephen Buchwald教授。2019–2022年在美國普林斯頓大學和康奈爾大學開展博士后研究，合作教師為Todd Hyster教授。葉宇軒博士于2022年9月全職加入西湖大學理學院擔任特聘研究員，主要研究方向為新型酶催化非天然反應的發(fā)展和應用。

葉宇軒課題組現(xiàn)面向國內(nèi)外招聘博士研究生、博士后、科研助理，歡迎對酶催化感興趣的同學申請。課題組主頁：ye.lab.westlake.edu.cn。