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由于氮原子普遍存在于小分子藥物和農用化學品中，因此發(fā)展高效的碳氮鍵構建方法在現(xiàn)代合成化學中至關重要。烯烴的氫-胺化是利用非活化烯烴構建碳氮鍵的一種原子經濟的合成策略。然而，在制備全取代的碳立體中心時，這些反應很難實現(xiàn)不對稱反應過程。最近，美國普林斯頓大學Todd K. Hyster課題組利用Baeyer-Villiger單氧酶實現(xiàn)了一種光酶催化烯烴的氫-胺化反應，構建了一系列2,2-二取代吡咯烷。通過五輪蛋白工程得到的蛋白突變體，可以以良好的產率和立體選擇性得到產物。機理方面，此轉化利用了還原生成的芐基自由基與氮原子的孤對電子之間的空間相互作用來構建C-N鍵，這與傳統(tǒng)的利用胺基或烯烴氧化構建C-N鍵有所不同（Figure 1）。歡迎下載化學加APP到手機桌面，合成化學產業(yè)資源聚合服務平臺。

（圖片來源：Nature）

首先，作者以帶有端烯的苯胺1為模板底物，探索了利用其構建2,2-雙官能團化吡咯烷的轉化（Figure 2）。通過對多種不同的黃素酶進行篩選，作者發(fā)現(xiàn)當使用AcCHMO（Acinetobacter calcoaceticus）時可以有效的實現(xiàn)5-exo-trig環(huán)化，以1%的產率，55:45 er得到吡咯烷產物2，且并沒有觀察到6-endo-trig產物3。而對于其它的酶，包括苯乙烯氧化酶、D-氨基酸氧化酶、單胺氧化酶、膽固醇氧化酶、氯氧化酶等均不能實現(xiàn)轉化。由于利用蛋白質工程可以有效改善反應的產率和立體選擇性，因此作者利用軟件進行結構預測，將酶通過五輪蛋白工程得到一個突變體，其可以以97%的產率，95:5 er，選擇性的得到吡咯烷產物2。分子動力學實驗表明R490E、I490T和A479H三個位點位于一個環(huán)狀區(qū)，是酶的活性位點。這種在遠端位點突變的設計在打開催化活性位點和實現(xiàn)位點與底物的接觸中起到至關重要的作用。隨后，作者測試了無細胞狀態(tài)下的酶催化活性。當將催化劑的載量降為0.04 mol %時，仍可以以17 %的產率得到產物4（TON = 436），且立體選擇性得到保持。此外，作者還發(fā)現(xiàn)當加入1.0 equiv NADP⁺可以抑制反應，因此其可以作為有效的抑制劑。

（圖片來源：Nature）

在最優(yōu)反應條件下，作者對此轉化的底物范圍進行了考察（Figure 3）。實驗結果表明，一系列不同取代的苯胺和苯乙烯均可良好兼容，以14-99%的產率得到相應的產物2-26。其中，富電子芳烴通常提供更高的產率和選擇性(2、4-10、13-20)。苯胺一側（10）和苯乙烯部分（19）上的大取代基，如萘，可以在沒有降低產率和對映選擇性的情況下進行轉化。此外，缺電子的氮雜環(huán)同樣是耐受的（11-12, 21），其克服了Br?nsted酸催化環(huán)化的局限性。遺憾的是，環(huán)化反應對雜環(huán)取代較敏感，反應會受到影響。而利用蛋白質工程可以克服這些限制。相應的同系化底物可以實現(xiàn)6-exo-trig環(huán)化，以13%的產率得到產物22，并具有良好的對映選擇性（78:22 er）。這是一個有趣的例子，因為當使用光氧化還原催化劑時，這種類型的底物通常會經歷1,5-HAT而非環(huán)化。

此外，利用此策略還可以以中等產率（42%）和對映體比（27:73）得到修飾的吡咯烷骨架23。接下來，作者利用此方法制備了三種芳基吡咯烷原料藥的α-甲基化類似物。包括TRK抑制劑GNF-862541的甲基化吡咯烷片段24（85%, 94:6 er）；改良的原肌球蛋白抑制劑片段α-甲基larorectinib 26（77%, 75:25）和其相關結構25（25%, 73:27）。這些合成過程表明，利用此方法可以很容易的制備通常需要多步合成的取代類似物。

 （圖片來源：Nature）

接下來，作者對反應機理進行了探索（Figure 4）。作者發(fā)現(xiàn)該反應具有一定的誘導期，且不是由反應物的氧化來啟動反應，誘導期的觀察表明氧化黃素不是自由基引發(fā)的原因，而是需要光還原才能發(fā)生反應。而當使用連二亞硫酸鈉還原酶進行催化反應時，在沒有誘導期的情況下以74 %的產率，95:5 er得到產物。UV-Vis光譜表明，連二亞硫酸鈉還原酶與光照還原酶是等效的。因此，此反應的誘導期是經歷了光化學還原FAD為FADhq。此外，作者利用控制實驗排除了能量轉移機理的可能?；谏鲜鰧嶒灲Y果，作者得出反應首先經歷了烯烴被FADhq*還原。由于FADhq*的E⁰為-2.26 V vs. SCE，因此其無法還原α-甲基苯乙烯（E^red = -2.6 V vs. SCE）。但是正電性的活性位點可以減小反應物的還原電勢，而且可以穩(wěn)定FAD_sq^-。這種陰離子具有很強的堿性，能夠快速且不可逆的脫質子，從而形成芐基自由基。    

 （圖片來源：Nature）

作者通過研究發(fā)現(xiàn)，芐基自由基和苯胺之間的相互作用會影響氧化還原過程，且這種作用關系在以往的報道中還未出現(xiàn)。由于氮原子的孤對電子和自由基之間的超共軛作用，可以有效增加SOMO軌道的能量，使自由基更容易被氧化。因此此轉化經歷了一種與小分子催化完全不同的氫-胺基化機理。其利用芐基自由基與氮原子的孤對電子之間的空間相互作用來降低酶催化位點的自由基氧化還原電勢從而構建C-N鍵。