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軸手性分子作為一類優(yōu)勢骨架，在天然產(chǎn)物、藥物化學(xué)、不對稱催化及材料科學(xué)等多個研究領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。除最為常見的聯(lián)芳基軸手性結(jié)構(gòu)外，非聯(lián)芳基類阻轉(zhuǎn)異構(gòu)體，如酰胺、苯乙烯、苯胺及酰亞胺等化合物，因其獨(dú)特的軸向手性以及多樣化的功能，近年來受到廣泛關(guān)注（圖1A）。其中，芳基酰胺類化合物因Caryl–Camide鍵的旋轉(zhuǎn)受限而表現(xiàn)出穩(wěn)定的軸手性，在生物活性分子的構(gòu)建及不對稱催化等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價值。然而，該類軸手性芳基酰胺的不對稱催化合成策略仍不夠成熟，其主要挑戰(zhàn)在于Caryl–Camide鍵的旋轉(zhuǎn)能壘相對較低，使得該手性軸的立體化學(xué)控制與構(gòu)型保持變得尤為困難。

近年來，生物催化在構(gòu)建軸手性分子領(lǐng)域取得顯著進(jìn)展，多種酶催化劑—從傳統(tǒng)脂肪酶、酮還原酶到亞胺還原酶、烯烴還原酶、細(xì)胞色素P450乃至人工金屬酶—已被成功應(yīng)用于軸手性分子的不對稱合成。然而，現(xiàn)有研究多集中于經(jīng)典的聯(lián)芳基骨架體系，針對軸手性酰胺的酶催化構(gòu)建方法仍無報道（圖1B）。

近日，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所付海根課題組與宋丹青課題組合作，利用亞胺還原酶（IREDs）催化的動態(tài)動力學(xué)拆分策略，首次實(shí)現(xiàn)了軸手性芳基酰胺類分子的酶催化不對稱合成。該DKR過程包含兩個關(guān)鍵步驟：首先，鄰位含有醛基的芳香酰胺底物（rac-4a）可借助酰胺氮原子的孤對電子與醛基之間產(chǎn)生n→π相互作用，有效降低手性軸的旋轉(zhuǎn)能壘，促使底物快速消旋；隨后，IREDs通過高度立體選擇性地還原其中一種亞胺對映體，最終高效生成光學(xué)純的芳香酰胺類軸手性產(chǎn)物（圖1C）。

圖1. 生物催化合成芳基酰胺類化合物。圖片來源：J. Am. Chem. Soc.

作者首先以消旋萘甲酰胺醛4a與芐胺5a作為模板底物，對一系列野生型亞胺還原酶（IREDs）進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)來源于Kutzneria albida的IRED-68雖在初步篩選中活性較低（產(chǎn)率10%），但對目標(biāo)產(chǎn)物表現(xiàn)出優(yōu)異的立體選擇性（96:4 er）。為進(jìn)一步提升催化效率，研究團(tuán)隊解析了IRED-68的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，并基于結(jié)構(gòu)信息對其活性中心的13個關(guān)鍵殘基進(jìn)行了迭代飽和突變，最終獲得四重突變體 IRED-68-M4（V123Q/S233G/V232H/A122T）。該突變體相較于野生型蛋白，比活性提高了135倍。在后續(xù)反應(yīng)優(yōu)化中，采用粗酶凍干粉（4 mg/mL）并添加表面活性劑TPGS-750-M（2 wt%），模型反應(yīng)的產(chǎn)率可提高至94%，對映選擇性達(dá)到99:1 er。

圖2. 模板反應(yīng)篩選與優(yōu)化。圖片來源：J. Am. Chem. Soc.

隨后，作者對突變體IRED-68-M4的底物適用范圍進(jìn)行了系統(tǒng)評估（圖3）。結(jié)果表明，該突變體具有良好的底物兼容性，可高效催化多種取代芐胺、雜環(huán)取代甲胺、苯乙胺及苯胺等胺類底物。除萘甲酰胺（6–36）結(jié)構(gòu)外，該酶對苯甲酰胺衍生物（37–40）也表現(xiàn)出較高催化活性，多數(shù)底物可獲得70%–98%的產(chǎn)率，并保持優(yōu)異的對映選擇性（最高er > 99:1）。此外，研究團(tuán)隊成功實(shí)現(xiàn)了化合物10的克級規(guī)模制備，以84%的產(chǎn)率獲得1.28 g目標(biāo)產(chǎn)物（98:2 er），進(jìn)一步證明了該方法在合成應(yīng)用中的潛力。

圖3. 底物范圍拓展。圖片來源：J. Am. Chem. Soc.

最后，作者結(jié)合X射線晶體學(xué)與分子對接分析，揭示了IRED-68-M4突變體催化性能提升的機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，突變位點(diǎn)V123Q可與還原型輔因子NADPH的煙酰胺環(huán)形成額外氫鍵，從而可能增強(qiáng)與輔因子的結(jié)合能力。ITC結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，突變體IRED-68-M4對NADPH的結(jié)合能力顯著高于野生型IRED-68-WT（KD = 4.1 μM vs. 27.4 μM）。分子對接結(jié)果表明，V232H位點(diǎn)可與亞胺底物42的苯環(huán)產(chǎn)生π–π相互作用，而S233G位點(diǎn)則擴(kuò)大了活性中心空腔，有利于大體積底物的結(jié)合與進(jìn)入。此外，通過單位點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，作者鑒定出D170為潛在的質(zhì)子給體（圖4）。

圖4. 結(jié)構(gòu)及機(jī)理解析。圖片來源：J. Am. Chem. Soc.

總結(jié)

本研究基于動態(tài)動力學(xué)拆分策略，首次實(shí)現(xiàn)了軸手性芳基酰胺類分子的生物催化不對稱合成。通過高效的蛋白質(zhì)工程改造，成功獲得了催化性能優(yōu)異的IRED-68-M4突變體，該酶兼具高活性、高對映選擇性及廣泛的底物適用性，為構(gòu)建非聯(lián)芳基軸手性分子提供了新型酶催化工具。該研究成果發(fā)表于J. Am. Chem. Soc.，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所博士研究生姚周暢和孟潤澤為本文共同第一作者；黃玲博士、宋丹青研究員、付海根研究員為共同通訊作者。研究過程中，楊兆勇課題組為本工作提供了重要支持。

原文鏈接

Zhouchang Yao, Runze Meng, Zitian Zhou, Luyao Yu, Zhiyun Wu, Longqing Tang, Tianzhang Qiao, Ke Li, Ling Huang,* Danqing Song,* Haigen Fu.*Engineering an Imine Reductase for Enantioselective Synthesis of Atropisomeric Amides. J. Am. Chem. Soc., 2025, https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.5c12724.

博后招聘、博士生招生信息

付海根，現(xiàn)任中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所研究員，主要從事生物催化與藥物化學(xué)研究。近年來以第一或通訊作者在Nature、Nature Catalysis、JACS、Angewandte Chemie等國際高水平期刊發(fā)表論文十余篇，并于2022年入選國家高層次青年人才計劃。

課題組研究方向聚焦于生物催化及藥物化學(xué)，經(jīng)費(fèi)充足，實(shí)驗(yàn)條件完善?，F(xiàn)誠聘博士后1–2名，歡迎具有有機(jī)化學(xué)、生物催化、生物合成或藥物化學(xué)等相關(guān)背景的優(yōu)秀青年學(xué)者加入。課題組將全力支持入選者申請“協(xié)和青年學(xué)者”等人才項(xiàng)目。同時，歡迎對生物催化、藥物設(shè)計等方向有濃厚興趣的同學(xué)報考2026年入學(xué)博士研究生（擬招收1–2名）。期待有志于前沿科學(xué)探索的青年人才加入我們，共同成長。請發(fā)送相關(guān)材料到付老師郵箱fuhaigen@imb.pumc.edu.cn。