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Tetronate類(lèi)抗生素是一類(lèi)以乙酰乙酸內(nèi)酯基團(tuán)為特征且數(shù)量持續(xù)增長(zhǎng)的天然產(chǎn)物，因其多樣的生物活性和特征結(jié)構(gòu)而備受關(guān)注。值得注意的是，由環(huán)己烯和tetronate片段以螺環(huán)方式相連形成的大環(huán)化spirotetronate產(chǎn)物，如chlorothricin、kijanimicin和lobophorin A等，是tetronate家族中最具代表性和數(shù)量最龐大的成員。其經(jīng)典的核心結(jié)構(gòu)已被證明遵循統(tǒng)一的生物合成邏輯：在形成成熟的tetronate線(xiàn)性聚酮后，由兩步酶促分子內(nèi)Diels-Alder（IMDA）級(jí)聯(lián)反應(yīng)完成骨架組裝（圖1A）。然而，在線(xiàn)性聚醚tetronate類(lèi)天然產(chǎn)物（如tetronasin和tetronomycin）的生物合成中，催化上述級(jí)聯(lián)D-A反應(yīng)的兩類(lèi)同源蛋白發(fā)揮了不同的功能，依次催化了一步雜D-A反應(yīng)和一步周環(huán)重排（圖1B）。這些研究體現(xiàn)了同源生物合成酶在進(jìn)化過(guò)程中的功能創(chuàng)新，從而驅(qū)動(dòng)天然產(chǎn)物的化學(xué)多樣性。

本課題組聚焦非經(jīng)典tetronate天然產(chǎn)物lucensimycin A，開(kāi)展生物合成研究，通過(guò)體內(nèi)基因敲除、體外酶學(xué)表征、化學(xué)衍生化策略和結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段，完整解析了其生物合成途徑，并揭示通過(guò)酶促立體選擇性親核取代反應(yīng)構(gòu)建非典型螺環(huán)骨架的全新機(jī)制（圖1C），相關(guān)成果發(fā)表于Journal of the American Chemical Society。

圖1

Lucensimycin A（1）的核心結(jié)構(gòu)為罕見(jiàn)的由多氫菲和tetronate以螺環(huán)方式相連（spiro[tetronate-hydrophenanthrene]）的四環(huán)骨架，并且該螺環(huán)中心的立體構(gòu)型長(zhǎng)期未被解析。與常規(guī)的含有spiro[tetronate-hexene]的spirotetronate類(lèi)大環(huán)化合物的五環(huán)結(jié)構(gòu)相比，1的剛性四環(huán)結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)類(lèi)似的萘環(huán)片段，而tetronate基團(tuán)的環(huán)外雙鍵卻依舊保留，暗示了其螺環(huán)的形成與經(jīng)典的依賴(lài)IMDA反應(yīng)的螺環(huán)形成存在差異，可能涉及獨(dú)特的環(huán)化策略。 

圖2

通過(guò)基因簇比對(duì)發(fā)現(xiàn)：lucensimycin A的基因簇（luc）與經(jīng)典spirotetronate基因簇（chl）高度同源，包含保守的聚酮合酶（PKS）、tetronate形成模塊（LucL1-L5）及兩類(lèi)D-A同源酶（LucM/LucK）（圖2B）。在對(duì)lucL1-L5進(jìn)行敲除和表達(dá)的過(guò)程中，研究人員依次鑒定了tetronate成熟過(guò)程中關(guān)鍵的羥基（3）、乙?；?/span>4）和脫水中間體（5），證實(shí)其tetronate基團(tuán)的生物合成遵循保守途徑，與abyssomicin、agglomerin等tetronate聚酮的合成策略一致。

LucM與LucK分別和pyrroindolmycin生物合成中的D-A酶PyrE3 (39%/100%)和PyrI4 (22%/62%)同源。lucM的敲除結(jié)果表明，LucM作用于tetronate形成模塊的下游；結(jié)合體外酶反應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)LucM能夠通過(guò)endo選擇性的IMDA反應(yīng)，催化線(xiàn)性前體高效構(gòu)建十氫萘環(huán)核心骨架（6）。這一催化過(guò)程與PyrE3在pyrroindolmycin生物合成途徑中所發(fā)揮的功能高度相似。 

圖3

ΔlucK敲除株積累了三個(gè)代謝產(chǎn)物7（6的2-羥基乙酰化衍生物）、8和8'?；?/span>NOE分析、DFT 計(jì)算和SNAC衍生化，8和8'被證實(shí)具有相同的四環(huán)平面結(jié)構(gòu)，其差異僅在螺環(huán)中心C-12的立體構(gòu)型（8: 12R；8': 12S）。研究人員發(fā)現(xiàn)，7在酸性條件下會(huì)迅速自發(fā)轉(zhuǎn)化為8和8'，轉(zhuǎn)化比例為3:1；而在中性條件下，LucK可高效催化7向8的轉(zhuǎn)化（90% de）。投喂實(shí)驗(yàn)顯示，僅8能特異性恢復(fù)終產(chǎn)物1的產(chǎn)生，證實(shí)其為真正的生物合成中間體，并確立1螺環(huán)中心的立體構(gòu)型與8一致。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，D-A酶同源蛋白LucK在lucensimycin A生物合成過(guò)程中，并未識(shí)別底物中潛在的D-A反應(yīng)活性基團(tuán)，而是罕見(jiàn)地催化了一步分子內(nèi)親核取代反應(yīng)，立體選擇性地形成非典型的螺環(huán)中心。此外，體內(nèi)結(jié)果表明，LucM與LucK并非連續(xù)作用，而是由?；D(zhuǎn)移酶LucN對(duì)LucM的催化產(chǎn)物乙?；揎椇?，再進(jìn)行環(huán)化。

在完成spiro[tetronate-hydrophenanthrene]四環(huán)骨架的構(gòu)建后，化合物8的四烯鏈末端仍需經(jīng)歷氧化裂解過(guò)程，才能形成終產(chǎn)物1。進(jìn)一步的敲除實(shí)驗(yàn)和體外酶反應(yīng)證實(shí)，LucO3作為首個(gè)在非類(lèi)胡蘿卜素天然產(chǎn)物生物合成途徑中被表征的類(lèi)胡蘿卜素裂解雙加氧酶（CCD），可特異性催化化合物8末端烯烴的氧化斷裂，生成醛基中間體；LucI繼而催化該醛基氧化為羧酸，最終完成lucensimycin A的生物合成（圖2C）。 

圖4

最后，鑒于LucK相較于其同源蛋白在tetronate類(lèi)天然產(chǎn)物生物合成途徑中的特殊催化功能，本研究解析了LucK 1.9 ?的晶體結(jié)構(gòu)，其三維結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)保守的β-桶狀折疊，通過(guò)分子對(duì)接和點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，證實(shí)其依賴(lài)Glu16/Glu85驅(qū)動(dòng)親核環(huán)化反應(yīng)的酸堿催化機(jī)制（圖4）。

本研究完整解析了非典型tetronate類(lèi)天然產(chǎn)物lucensimycin A的生物合成過(guò)程。其中，關(guān)鍵的環(huán)化酶LucK立體選擇性地催化了一步親核環(huán)化反應(yīng)，從而形成罕見(jiàn)的spiro[tetronate-hydrophenanthrene]四環(huán)骨架。針對(duì)LucK的結(jié)構(gòu)解析，初步揭示β桶狀蛋白通過(guò)廣義酸堿催化機(jī)制介導(dǎo)的全新反應(yīng)類(lèi)型，為tetronate類(lèi)化合物的化學(xué)多樣性與生物合成之間的關(guān)系提供了新見(jiàn)解，同時(shí)也暗示了在天然產(chǎn)物生物合成途徑中，大量由已充分表征的酶催化劑所介導(dǎo)的非經(jīng)典酶促轉(zhuǎn)化仍有待進(jìn)一步發(fā)掘。

南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院博士生奚萌宇為文章第一作者，戈惠明教授和張博副教授為通訊作者。該研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金委及科技部項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)的資助。

文獻(xiàn)詳情：

Enzymatic Stereoselective Nucleophilic Cyclization Governs AtypicalSpirotetronate Assembly in Lucensimycin A Biosynthesis 

Meng Yu Xi，Bo Zhang*，Ting Peng，Xiu Xiu Ma，Ao Zhu，Zi Jie Wang，Yucheng Gu，Ren Xiang Tan，Hui Ming Ge*

J. Am. Chem. Soc. 2025

https://doi.org/10.1021/jacs.5c07754

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